DMD вызывается мутациями в гене dystrophin, это Х-сцепленное дегенеративное заболевание мышц , возникающее у 1.7-2.1 из 10 000 новорожденных мальчиков.^1-3 Гомозиготные девочки редки, а гетерозиготные являются носителями, примерно 20% из них обнаруживают симптомы носителей с поздними и легкими проявлениями болезни по сравнению с мальчиками.^4-6 У DMD пациентов мутации в dystrophin приводят к дестабилизации dystrophin glycoprotein complex (DGC) и нестабильности сарколеммы, приводящих к функциональному дефициту.⁷ Дистрофин также играет роль в закреплении ассоциированных с дистрофином белков с сарколеммой, включая nitric oxide synthase (nNOS).⁸ Отсутствие функционального дистрофина в конечном итоге приводит к дегенерации и гибели скелетных и сердечной мышц, которые замещаются фиброзной тканью.⁹ DMD симптомы проявляются в раннем детстве, появляясь в основном в утомляемости мышц. С возрастом болезнь прогрессирует и они оказываются в инвалидном кресле уже в 10 лет. В конечном счете нарушается дыхательная функция и становится необходимой механическая поддержка. Дисфункция сердца обычно проявляется у поздних подростков или сразу после 20, но в конечном итоге dilated cardiomyopathy (DCM) и застойная сердечная недостаточность сопровождаются вентрикулярной и суправентрикулярной аритмиями. Пациенты погибают из-за респираторной и сердечной недостаточности.¹⁰

У женских эмбрионов Х хромосомы инактивируются случайным образом, это ведет к мозаицизму Х-сцепленных аллелей, это объясняет, почему гетерозиготные девочки обычно слабо затронуты или не обнаруживают симптомов. iPSCs способны генерировать модели болезней человека для изучения лежащих в основе механизмов на уровне специфических типов клеток. Предыдущие исследования эффектов репрограммирования статуса Х подтвердили три возможных исхода: (1) состояние X chromosome inactivation (XCI) поддерживается в ходе всего процесса репрограммирования; (2) инактивированная X хромосома реактивируется; (3) инактивированная X хромосома разрушается (eroded).^11-18

Чтобы исследовать электрофизиологические аномалии, вызываемые мутациями дистрофина, в кардиомиоцитах, мы генерировали iPSCs от двух DMD пациентов: мальчика и девочки, гетерозиготной носительницы с проявлением болезни. Статус инактивации Х и экспрессия гена дистрофина были проанализированы в iPSCs и iPSC-CMs, сгенерированными от здорового контроля и пациентов обоих полов в отношении генетических, молекулярных и функциональных аномалий. В подтверждение гипотезы, что мутантные по дистрофину iPSC-CMs от мутантного мальчика и гетерозиготной девочки носительницы обладают ключевыми признаками DMD, мутантные кардиомиоциты обнаруживают молекулярные, генетические и электрофизиологические аномалии, включая аритмии.

Экспрессия мРНК и белка дистрофина была проанализированы с помощью qRT-PCR, RNAseq, Western blot и immunofluorescence окрашивания. Для обстоятельного электрофизиологического анализа использовали current и voltage электроды (clamp), чтобы записать трансмембранный потенциал действия и ток ионов, соотв. Набор микроэлектродов был использован для записи внеклеточных электрограмм. X-inactive specific transcript (XIST) и анализ экспрессии дистрофина выявили, что iPSCs девочки подвержены X хромосомной реактивации (XCR) или нарушению инактивации Х хромосомы, которые могли сохраняться в iPSC-CMs девочки, обладающих смешанной экспрессией Х хромосомы дикого типа (WT) и мутантного аллеля. iPSC-CMs девочки и мальчика обнаруживали присутствие низкой спонтанной частоты возбуждения (firing rate), аритмии и более длинный потенциал действия. iPSC-CMs от DMD девочки обнаруживали повышенную скорость вариабельности возбуждений (beat rate variability (BRV). У DMD мальчика iPSC-CMs обнаруживали сниженную плотность If, и у DMD девочки и мальчика iPSC-CMs обнаруживали повышенную плотность ICa, L . Эти находки демонстрируют клеточные механизмы, лежащие в основе электрофизиологических аномалий и кардиальной аритмии при DMD.

Induction of muscle specific dystrophin and dystrophin?glycoprotein complex (DGC) expression during iPSC?CM differentiation. (A) Immunofluorescence staining of iPSC?CMs >30 d shows presence of sarcomere localized Troponin I and dystrophin expression (C?terminal antibody). Dystrophin is reduced in all DMD iPSC?CMs and some DMD female iPSC?CMs. (B) mRNA expression of muscle specific 427 kD dystrophin (DMD?N) and DGC components in DMD male and control iPSC?CMS; n = 2?5 independent differentiations for each time point. (C) Western blotting of full?length dystrophin, slow skeletal troponin I (ssTnI, 22 kD), and cardiac troponin I (cTnI, 26 kD) in control and DMD iPSC?CMs, and adult left ventricle (LV) tissue lysates. iPSC?CMs were collected at >30 d (d). Mean dystrophin/TnI ratio by densitometry was 6.3, 1.1 and <0.02 in control, DMD female and male preparations, respectively. LV adult tissue lysates were generated from adult control (C) and Becker muscular dystrophy (BMD) patients with an in?frame dystrophin deletion leading to truncated dystrophin (B). (D) Wheat germ agglutinin (WGA) purification enriches the glycosylated proteins of the dystrophin?glycoprotein complex and dystrophin in control (CTRL) iPSC?CMs, DMD female iPSC?CMs but is absent in DMD male iPSC?CM. LV tissue samples from adult control (LV) and BMD (LV?B) patients show enrichment of dystrophin as expected. Mixed expression of dystrophin (WT and mutated (ex.8_12del) alleles in the DMD female iPSC?CM population. (E) NGS analysis of the dystrophin alleles mRNA expression in DMD female and control iPSC?CMs. Fragments per kilobase of exon per million reads mapped (FPKM) values were normalized by library size and corrected by enrichment factor. Black arrow indicates zero expression of the mutated allele in control iPSC?CMs samples. Control n = 5; DMD female, n = 5. Two?way ANOVA followed by Holm?Sidak post?hoc analysis. ***P < 0.001. (F) Sashimi plot of the WT allele RNA in control iPSC?CMs (top) and both WT and mutated alleles RNA in DMD female iPSC?CMs (bottom). (G) Expression of XIST RNA in female compared to male human fibroblasts (HF), iPSC and iPSC?CM as determined by qRT?PCR. Expression of XIST was normalized to ??actin and relative expression levels are shown as 2???CT compared to the respective male control